Química

Bioquímica: Cinética de Michaelis - Menten. Significado de los parámetros. Inhibición. Efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática.

CINETICA ENZIMATICA

Cinética de Michaelis - Menten

Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque se aumente la concentración de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación se debe a que todos los centros activos están ocupados. La velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato suficiente. Consideraremos sólo la velocidad inicial de las reacciones para cada concentración de sustrato cuando se construya una gráfica, evitando el error introducido por el deterioro del enzima. Como en el primer momento no hay producto no consideraremos la reacción contraria.

CINETICA ENZIMATICA

La velocidad depende de una constante de velocidad K y de su inversa:

K1 K2

E + S ↔ ES ↔ E + P

K-1 K-2

El paso limitante en la velocidad es K2, por lo tanto la expresión de la velocidad será:

v = K2.[S]

Donde K2 también recibe el nombre de K CAT. La concentración de enzima será mucho menor que la de sustrato porque no se consume.

Los enzimas que siguen esta cinética se dice que siguen la cinética de Michaelis - Menten.

Al aumentar la concentración de enzima la gráfica es igual pero por arriba.

Ecuación de velocidad de Michaelis - Menten

La concentración de sustrato libre será prácticamente la concentración inicial porque la cantidad de enzima es muy pequeña. Haremos las siguientes consideraciones:

- S0 = [S] + [SE] donde [SE] puede despreciarse.

- ET = [E] + [ES]

- [E] ≠ ET

- la velocidad de transformación de sustrato en producto está limitada por K2

v0 = K CAT*[ES]

- Hipótesis del estado estacionario: como la concentración de enzima es muy pequeña y la concentración de sustrato muy grande en el primer momento se llega a una concentración de complejo enzima - sustrato que es constante para toda la reacción.

CINETICA ENZIMATICA

- El enzima siempre tiene moléculas de sustrato en su centro activo de manera que la concentración de enzima - sustrato será prácticamente constante por lo que:

velocidad de formación = velocidad de descomposición

K1.[E].[ES] = K-1.[ES] + K CAT.[ES]

[ES.(K + K CAT)]

CINETICA ENZIMATICA

A la relación entre constantes se le denomina constante de Michaelis - Menten:

Km = (K-1 + K cat)/K1

En lugar de ponerlo en función de enzima libre lo ponemos en función de complejo enzima - sustrato:

CINETICA ENZIMATICA

KM.[ES] = [E] - [S] - [ES].[S] ⇒ [ES](KM + [S]) = [E] + [S]

v0 = K cat.[ES] = K cat.[ET].[S]/(Km + [S]) = considerando que [ES] = [ET] ⇒ K cat = [ET] = V

Esto es válido para cuando todo el enzima esté formando complejo enzima - sustrato y si el enzima sigue la cinética de Michaelis - Menten.

v0 = V.[S]/(Km + [S])

- Si la concentración de sustrato es muy pequeña podemos despreciarla en el denominador.

v0 = V.[S]/Km

La velocidad crece proporcionalmente a la concentración de sustrato, es de orden 1 respecto a el sustrato.

- Si la concentración de sustrato es grande, Km es despreciable:

V = v0

La velocidad es independiente respecto a la concentración de sustrato. Es lo que ocurre en el tramo final de la gráfica que tiende asintóticamente a V. Es la ecuación de una hipérbola.

El enzima presenta saturación de velocidad respecto a la concentración de sustrato. El enzima no seguirá la cinética de Michaelis - Menten si tiene cooperatividad en la unión del sustrato por lo que la curva será sigmoidea. La V será igual y la saturación dependerá e la concentración de enzima. La saturación se alcanza para determinada concentración de enzima, si la concentración de enzima es el doble la velocidad será el doble. La velocidad y υ son dos formas de expresar la actividad de una proteína.

Significado de los parámetros

Km: Relación entre las constantes cinéticas. Caracteriza la interacción del enzima con su sustrato, aunque no depende de sus concentraciones. El valor fisiológico de Km va desde 10-1 hasta 10-7 M. Tiene unidades de concentración. Se puede calcular gráficamente su valor:

v0 = V/2 = V.[S]/(Km + [S]) → Km = [S]

CINETICA ENZIMATICA

Km tiene el mismo valor que la concentración de sustrato.

Se suele relacionar con otras constantes:

- Si Kcat es mucho más pequeña que K-1, Kcat es despreciable en el numerador:

Km = K-1/K1 = 1/K afinidad

Por lo tanto Km es una medida inversa de la afinidad del enzima por el sustrato. Al aumentar K m, K afinidad baja.

K cat: constante catalítica. Es la capacidad del enzima para llevar a cabo la transformación. Recibe también el nombre de número de recambios, cantidad máxima de moléculas transformadas por unidad de tiempo (sustrato, producto) por molécula de enzima o por número de sitios activos. Siempre en condiciones de saturación de manera que la cantidad de sustrato no sea limitante. Se mide en s-1. El número de recambios se calcula fácilmente:

K cat = V/[ET]

K CAT / KM : establecer eficacia catalítica del enzima. En las células para enzimas de Michaelis - Menten la concentración de sustrato es mucho más pequeña que Km, como mucho son iguales. Si la concentración de sustrato es mucho menor la velocidad cambia mucho para intervalos de concentración de sustrato pequeños. Podemos despreciar en el denominador:

v0 = V.[S]/K = (K cat /K m).[E].[S]

donde K CAT / KM es la constante de un proceso que depende de las concentraciones de enzima y sustrato (es como si fuera su constante de velocidad). Tiene un límite superior en K1. Ello significa que la reacción más rápida depende de K1 y ésta de la unión de enzima y sustrato. Los enzimas con cinética más rápida son los de difusión de enzima - sustrato más alta, que es la rapidez con la que el sustrato llega al sitio activo. Cada vez que un sustrato llega a un sitio se transforma, por lo que la velocidad depende de lo rápido que llega el sustrato al sitio.

CINETICA ENZIMATICA

Por ello K CAT = ∞. Para el enzima más rápido la velocidad depende sólo de K1. Los enzimas con Kcat/Km = K1 son los más rápidos posible y se dice que han alcanzado la perfección cinética.

Kcat/Km es el criterio de especificidad (grado de discriminación) que no depende de Km sino de Kcat/Km que permite distinguir entre dos sustratos con los que puede actuar.

E + A EA ◊P VA

E + B EB ◊p VB

Si el enzima es más específico por A entonces VA >VB, VA/VB > 1 prefiere A.. Si se ponen en concentraciones iguales siendo la concentración de enzima constante:

VA = K cat A/K m A.[E].[A]
VB = K cat B/K m B.[E].[B]

VA/VB = (K cat A/K m A)/(K cat B/K m B)

Cálculo gráfico.

CINETICA ENZIMATICA

Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de una recta, calculando sólo algunos puntos se puede obtener:

1/v0 = (K m + [S])/(V.[S]) = (K m/V).(1/[S]) + (1/V)

CINETICA ENZIMATICA

Inhibición

El efecto de un inhibidor es disminuir o bloquear la velocidad de una reacción catalizada uniéndose al enzima. La mayor parte de los enzimas están afectados. Son específicos, cualquier sustancia no sirve para unir cualquier enzima. Se alteran grupos importantes para la función catalítica o se altera ligeramente la conformación (con lo que la proteína ya no es activa) sin llegar a desnaturalizarlo. Los inhibidores sirven para distinguir los grupos esenciales.

Inhibición permanente: unión del inhibidor irreversible por medio de enlaces covalentes provocando una modificación química de los grupos catalíticos. Una vez modificado el enzima está siempre inhibido. Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor es permanente. Ejemplo: el iodoacetato reconoce grupos SH y OH y envenena la cisteína.

CINETICA ENZIMATICA

Inhibición reversible: La unión del inhibidor y el enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio se recupera la actividad. Hay varios tipos:

- Competitiva: inhibidor y sustrato compiten por unirse al enzima en el mismo sitio de manera que no se unen a la vez.

KI = [E].[I]/[EI]

Para eliminar el inhibidor (y aumentar la velocidad) aumentamos la concentración de sustrato y lo desplazamos. La V no se verá afectada porque V = K CAT [ET] aunque necesitaremos concentración de sustrato más alta que en ausencia de inhibidor. Cinéticamente se puede distinguir el tipo de inhibidor. Km determina la afinidad del enzima por el sustrato (concentración de enzima y velocidad constantes). Un inhibidor competitivo es como si bajara la afinidad y Km será mayor. La Kmcon inhibidor será Km² x () donde () depende de:

- Concentración de inhibidor: influye positivamente (+inhibidor, +Km).

- KI: gobierna la unión de inhibidor y enzima. Como está escrita en el sentido de la disociación cuanto más aumente KI menor será Km.

Km² = Km.() + [I]/KI

Haciendo la gráfica de doble inverso se averigua si el inhibidor es competitivo:

CINETICA ENZIMATICA

La recta tendrá la misma V pero la pendiente será más grande porque Kmes mayor, cortará en el mismo punto de ordenadas. Al aumentar la concentración de inhibidor la Km sube y se origina una familia de rectas que cortan a las ordenadas en el mismo punto y tienen la pendiente más grande.

Un inhibidor competitivo ha de cumplir un requisito: ser parecido al sustrato estructuralmente porque se acopla al mismo sitio activo. El succinato deshidrogenasa cataliza la reacción redox del succinato:

Succinato

Succinato
deshidrogenasa

Fumarato

Succinato

Fumarato

Dos inhibidores competitivos del succinato deshidrogenasa:

- Oxalacetato: COO‾ - CO - CH3- COO‾

- Malonato: COO‾ - CH2 - COO‾

- Inhibición acompetitiva: el inhibidor sólo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formará producto, por lo que la velocidad bajará. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformación y el enzima ya no es tan efectivo.

I = [E].[I]/[ESI]

No se puede superar la inhibición aumentando la concentración de sustrato. La V con inhibidor (VI) será más pequeña.

CINETICA ENZIMATICA

La Km será más pequeña, como si tuviera más afinidad:

CINETICA ENZIMATICA

El resultado es una recta nueva que corta en un valor más grande de ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la concentración de inhibidor obtenemos una familia de rectas con pendiente igual y corte en ordenadas más grande.

CINETICA ENZIMATICA

Inhibición mixta: intermedia entre acompetitiva y competitiva. El inhibidor (que no tiene porqué parecerse al sustrato) no se une al centro activo aunque tiene efecto de competitivo. La unión de uno y otro no son excluyentes. El resultado final depende de cual de los dos prevalezca.

CINETICA ENZIMATICA

Competitiva:

CINETICA ENZIMATICA

Km sube

Km = 1+ [I]/KI

Acompetitiva:

V no afectada

Km baja

Km = 1+ [I]/KI

Competitiva + Acompetitiva.

CINETICA ENZIMATICA

El valor del punto de corte en ordenadas depende del efecto que prevalezca.

- Inhibición no competitiva: si KI =K´I el inhibidor se une por igual al enzima que al complejo enzima - sustrato y K mI = K m. El punto de corte en abscisas es igual con inhibidor que sin él. En ordenadas es más grande por lo que V baja. Si K m se mantiene igual y V baja la pendiente aumenta.

E + S ⇔

Es ⇔

E + P

↓KI

↓K II

EI ⇔

ESI

 

VI < V ↔ CINETICA ENZIMATICA

KI m K mCINETICA ENZIMATICA

CINETICA ENZIMATICA

El punto de corte con las abscisas da prueba de la importancia de relativa del efecto competitivo o acompetitivo para que lo corte por encima o por debajo.

- Inhibición no competitiva: cuando KI = K´I. En este caso da igual unirse al enzima que al complejo enzima - sustrato, aunque no se transformará igual de bien porque V es diferente. Cuanto más se parezca el inhibidor al estado de transición del sustrato más eficaz será el inhibidor. Son inhibidores muy potentes de la actividad catalítica del enzima.

CINETICA ENZIMATICA

Efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática

Efecto del pH: afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras:

- la unión del sustrato es mejor o peor que antes.

- Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.

La velocidad enzimática se mide en M/t y la actividad enzimática en mol/t, y la unidad internacional μ mol/min,cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es la cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 mol/s y se la llama katal.

- Efecto de la temperatura: cuando la temperatura sube la velocidad de reacción aumenta. Existe una temperatura máxima a la cual la proteína se desnaturaliza dejando de ser funcional. La mayor parte de los enzimas se desnaturalizan a unos 50°C. La ribonucleasa se desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70°C.

Editor: Fisicanet ®

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